在未涉及正文分析介紹及闡述之前，首先給大家分享一個(gè)關(guān)于斑馬魚研究的框架圖：

從框架圖可以看出，該研究的目的及主要思路是：評(píng)估福美鋅（ziram）對(duì)斑馬魚發(fā)育的影響，主要從形態(tài)學(xué)、行為、生理學(xué)和分子四大方面來進(jìn)行探討。毋庸置疑，這也是今天將與大家分享的一篇使用Noldus（諾達(dá)思）的DanioVision(斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng))進(jìn)行斑馬魚研究與分析的文章，發(fā)表于2018年9月。研究著重強(qiáng)調(diào)以下幾點(diǎn)：

• 探討了福美鋅（ziram）殺菌劑的毒性對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響；
• 測(cè)量了線粒體生物能量學(xué)、幼魚行為和基因表達(dá)；
• 當(dāng)福美鋅（ziram）濃度>100nM時(shí),會(huì)引起致命性、發(fā)育性缺陷和脊索畸形；
• 暴露于亞致死劑量1nM和10nM 7天之后，幼魚行為開始發(fā)生變化。

關(guān)于福美鋅（ziram）

福美鋅（ziram）是一種廣譜農(nóng)藥\殺蟲劑，化學(xué)上稱之為：二甲基二硫代氨基甲酸鋅 (Houeto et al., 1995; Kanchi et al., 2014)，可用作殺蟲劑或殺菌劑。1960年在美國(guó)注冊(cè)，用于控制蘋果和梨子的黑星病、桃子的卷葉病、西紅柿的炭疽病和早疾病 (US EPA, 2004)。

福美鋅（ziram）與環(huán)境和人類健康密切相關(guān)，這就需要進(jìn)一步研究其在非靶標(biāo)生物和人類中的毒性及作用機(jī)制。譬如，流行性病學(xué)研究表明，單獨(dú)使用福美鋅（ziram）或與其它農(nóng)藥結(jié)合起來使用后，與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，如帕金森疾病 (Fitzmaurice et al., 2014; Rhodes et al., 2013; Wang et al., 2011)。福美鋅吞食有害、吸入有高毒性、刺激呼吸系統(tǒng)、對(duì)眼睛有嚴(yán)重傷害，對(duì)水生生物有*的毒性，可能對(duì)水體環(huán)境產(chǎn)生長(zhǎng)期不良影響。

因此，量化ziram這類殺菌劑的負(fù)面影響，有利于更好地掌握它們與神經(jīng)性退行疾病之間的關(guān)系，從而更好地對(duì)毒理、藥理進(jìn)行研究。

斑馬魚作為模式動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)

斑馬魚是評(píng)估神經(jīng)毒性及神經(jīng)行為毒性的模式動(dòng)物，因?yàn)樗前l(fā)展很迅速的脊椎動(dòng)物，有良好的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng) (Panula et al., 2010)，此外，斑馬魚早期生長(zhǎng)階段對(duì)環(huán)境污染和藥物比較敏感(Jin et al., 2009; Schulz et al., 2010)。

斑馬魚基因與人類基因的相似度達(dá)到87%，這意味著在其身上做藥物實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體；再加上其胚胎是透明的，更容易觀察到藥物對(duì)其體內(nèi)器官的影響。

已有研究探討過福美鋅（ziram）對(duì)斑馬魚幼魚行為的影響(Lulla et al., 2016)。但研究的具體內(nèi)容和深度與本研究不同，本研究是從深度、廣度兩方面將福美鋅（ziram）對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響詮釋的。

主要研究結(jié)果

斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng) (DanioVision) 是一個(gè)完整解決方案，由 DanioVision 觀察箱、溫控模塊， 以及預(yù)裝于計(jì)算機(jī)的 EthoVision XT 組成。該系統(tǒng)是用于斑馬魚或其他極小型動(dòng)物高通量追蹤 的創(chuàng)新系統(tǒng)。借助 Noldus 的動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)可同時(shí)在多孔板高精度追蹤多達(dá)96只動(dòng)物。

本研究就是使用了該系統(tǒng)，通過96孔板對(duì)斑馬魚在光區(qū)、暗區(qū)的活動(dòng)及行為進(jìn)行觀察和分析，再結(jié)合其他分析工具和方法，終得到研究結(jié)果。

表1

表1為在96h之后斑馬魚胚胎中福美鋅（Ziram）的LC₅₀值，從表1數(shù)據(jù)結(jié)果，我們可以看出96h時(shí)LC₅₀ 為1082.54（相當(dāng)于0.33 mg/L），表明福美鋅（Ziram）對(duì)斑馬魚胚胎具有較高的毒性。

圖1

圖1為96h之后福美鋅（ziram）引起的斑馬魚胚胎的死亡率和發(fā)育障礙情況。其中A為受精24,48,72和96h胚胎的累計(jì)死亡率；B為受精72和96h胚胎的累計(jì)孵化率；C為受精48,72和96h胚胎20s內(nèi)的心跳；D為受精48,72和96h胚胎的脊索畸變率。從圖1可以看出：

1、斑馬魚受精96h時(shí)對(duì)照組與福美鋅（ziram）濃度為1nM和10nM條件下的死亡率、孵化率、心跳和脊索畸變率無明顯差異。相反地，福美鋅（ziram）濃度為100nM和1000nM時(shí)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在這些方面有明顯差異。

2、福美鋅（ziram）濃度為100nM，斑馬魚受精72h和96h時(shí)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率有顯著差異（圖1A）；此外，福美鋅（ziram）濃度為1000nM，斑馬魚受精24h時(shí)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率也有顯著差異（圖1A）。

3、與對(duì)照組相比，福美鋅（ziram）濃度為100nM、1000nM，斑馬魚受精72h和96h時(shí)，累計(jì)孵化率顯著下降（圖1B）。在高劑量1000nM條件下，實(shí)驗(yàn)組累計(jì)孵化率要比對(duì)照組少4倍左右。同時(shí)還評(píng)估了斑馬魚在受精48,72和96h時(shí)的心跳（圖1C）。福美鋅（ziram）濃度為100nM、1000nM，斑馬魚受精48h,72h和96h時(shí), 與對(duì)照組相比，心跳顯著減少（圖1C）。福美鋅（Ziram）濃度為100nM、1000nM，脊索畸變率隨著時(shí)間的增加而上升（圖1D）。

圖2

圖2為斑馬魚受精72h和96h，福美鋅（Ziram）濃度為100nM、1000nM代表性圖片。A和D（對(duì)照組）；B和E（100nM Ziram ）、C和F為實(shí)驗(yàn)組（1000nM Ziram ）。從圖2可得知：

斑馬魚受精受精72h和96h時(shí)，福美鋅（Ziram）濃度為100nM、1000nM福美鋅（Ziram），有嚴(yán)重的脊索畸變（圖2）,紅色箭頭為畸變的具體位置，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚脊索嚴(yán)重扭曲。

圖3

圖3為斑馬魚幼魚在福美鋅（ziram）濃度為10nM時(shí)的行為反應(yīng)（7天觀察）。A為60min內(nèi)的總活動(dòng)；B為60min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)速度；C為60min內(nèi)光區(qū)與暗區(qū)的運(yùn)動(dòng)距離；D為60min內(nèi)光區(qū)與暗區(qū)的運(yùn)動(dòng)速度；E為每15min移動(dòng)的總距離；F為在暗區(qū)的平均時(shí)間；G為每15min在暗區(qū)的頻率；H為每15min在暗區(qū)的累計(jì)時(shí)間。

研究對(duì)不同胚胎使用相同劑量進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，福美鋅（ziram）濃度為10nM時(shí),實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚幼魚活動(dòng)顯著增加。（圖3A）；斑馬魚幼魚在光區(qū)的移動(dòng)速度顯著提高（圖3D）；總活動(dòng)距離在第二個(gè)15min顯著增多（圖3E）。

相反地，與對(duì)照組相比， 1nM、10nM福美鋅濃度導(dǎo)致斑馬魚幼魚在暗區(qū)的第二個(gè)15min的平均時(shí)間明顯減少；但光/暗區(qū)的總速度、距離，暗區(qū)運(yùn)動(dòng)速度、頻率、累計(jì)時(shí)間方面沒有發(fā)生顯著變化（圖3B、C、D、G、H）。

以上便是給大家介紹的該研究的主要研究結(jié)果（其它研究結(jié)果可向我們獲取相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步了解），從上述內(nèi)容可以看出，福美鋅（ziram）對(duì)斑馬魚的影響是極其深遠(yuǎn)的（從形態(tài)學(xué)方面到具體的行為活動(dòng)反應(yīng)）。一句話概括來說就是：福美鋅（ziram）的毒性對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育有負(fù)面影響，具體體現(xiàn)如上文詳細(xì)闡述的內(nèi)容。

該研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了以往的研究結(jié)果，豐富了斑馬魚研究領(lǐng)域的內(nèi)容，為斑馬魚進(jìn)一步研究開拓了新的思路。

參考文獻(xiàn)

1. Fangjie Cao, Christopher L. Souders II, Pengfei Li,Ondrej Adamovsky, Sen Pang, Lihong Qiu,Christopher J. Martyniuk.,2018.Developmental toxicity of the fungicide ziram in zebrafish.
2. Fitzmaurice, A.G., Rhodes, S.L., Cockburn, M., Ritz, B.,Bronstein, J.M., 2014. Aldehyde dehydrogenase variation enhances effect ofpesticides associated with Parkin-son disease. Neurology 82, 419e426.
3. Houeto, P., Bindoula, G., Hoffman, J.R., 1995.Ethylenebisdithiocarbamates and ethylenethiourea: possible human healthhazards. Environ. Health Perspect. 103, 568e573.
4. Jin, Y., Chen, R., Sun, L., Qian, H., Liu, W., Fu, Z.,2009. Induction of estrogen-responsive gene transcription in the embryo, larval,juvenile and adult life stages of zebra?sh as biomarkers of short-term exposureto endocrine dis-rupting chemicals. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol.Pharmacol. 150, 414e420.
5. Lulla, A., Barnhill, L., Bitan, G., Ivanova, M.I.,Nguyen, B., O'Donnell, K., Stahl, M.C., Yamashiro, C., Klarner, F.G., Schrader,T., Sagasti, A., Bronstein, J.M., 2016. Neurotoxicity of the Parkinsondisease-associated pesticide ziram is synuclein-dependent in zebra?sh embryos.Environ. Health Perspect. 124, 1766e1775.
6. Panula, P., Chen, Y.C., Priyadarshini, M., Kudo, H.,Semenova, S., Sundvik, M., Sallinen, V., 2010. The comparative neuroanatomy andneurochemistry of zebra?sh CNS systems of relevance to human neuropsychiatricdiseases. Neu-robiol. Dis. 40, 46e57.
7. Rhodes, S.L., Fitzmaurice, A.G., Cockburn, M., Bronstein,J.M., Sinsheimer, J.S., Ritz, B., 2013. Pesticides that inhibit theubiquitin-proteasome system: effect measure modi?cation by genetic variation inSKP1 in Parkinsons disease. Environ. Res. 126, 1e8.
8. Schulz, R.W., de Franca, L.R., Lareyre, J.J., Le Gac, F.,Chiarini-Garcia, H., Nobrega, R.H., Miura, T., 2010. Spermatogenesis in ?sh.Gen. Comp. Endocrinol. 165, 390e411.
9. Wang, A., Costello, S., Cockburn, M., Zhang, X.,Bronstein, J., Ritz, B., 2011. Parkinson's disease risk from ambient exposureto pesticides. Eur. J. Epidemiol. 26, 547e555.